/ 中国兽医发布_动物源性食品中兽药残留的检测——大环内酯类药物残留

中国兽医发布_动物源性食品中兽药残留的检测——大环内酯类药物残留

由曲志娜 赵思俊等发表于2021-07-23 17:13:06

大环内酯类药物(macrolidesMALs)是利用放线杆菌或小单孢菌生产的具有大环状内酯环化合物的总称。MALs通过食物链进入人体,对人类健康构成严重威胁,因此MALs在动物源性食品中的残留监测和控制已受到许多国家的高度重视。
MALs结构中含有141516元内酯环母核,并通过苷键连接有13个中性或碱性糖链(如红霉脱氧糖胺、红霉糖、碳霉糖、海藻糖胺等)。根据内酯环母核中的原子数目,可将临床上最常用的MALs分为三类。红霉素、罗红霉素、克拉霉素是14元,而阿奇霉素为15元,螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素为16元。阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素均为红霉素的衍生物。替米考星由泰乐菌素合成。一般来讲,MALs的解离常数pKa7.19.9。一些抗生素对pH较为敏感,在酸性条件下易降解。另外,有一类多烯类大环内酯类药物具有2040元大内酯环母核,通过38个碳碳双键与糖链相连。38元多烯类大环内酯药物分别是制霉菌素A1(六烯化合物)和两性霉素B(七烯化合物),常用于人医临床。临床和畜牧生产中使用的MALs多属结构中含有氨基取代基的大环内酯类药物(又称碱性MALs),本部分综述了该类药物的理化性质、药理与代谢、国内外限量要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容,以期为该类药物的全面了解和残留检测提供参考。
1 理化性质
MALs的结构特征是含有一个被高度取代的14元或16元内酯环苷,内酯环通过苷键与12个糖链(二甲氨基糖或中性糖)连接。除内酯结构外,苷结构中含有烷基、羟基、氧烷基、环氧基、酮基或醛基,多数还含有共轭二烯或α,β不饱和酮。所以根据构成内酯环骨架原子数目或紫外吸收特征可对MALs进行分类(表5-6和图5-8)。
除主成分外,微生物还产生一些相关的次要组分(图5-8),控制这些亚组分的含量是药品质量监控的重要方面,但残留分析中一般仅选择主成分和(或)其代谢物作为残留标志物。EU已禁止将MALs作为促生长剂使用。
MALs的理化性质可概括如下:
MALs为无色弱碱性化合物(赛地卡霉素呈中性),相对分子质量较高(500900),多呈负旋光性,易溶于酸性水溶液和甲醇、乙腈、乙酸乙酯、氯仿、乙醚等极性溶剂;在pH6.08.0水溶液中相对稳定,抗菌活性最高;但在酸性条件下(pH4时)苷键易水解。

多数MALs200300nm处存在吸收峰,含有共轭碳碳双键或α,β不饱和酮结构的药物在此范围内呈现强的紫外吸收,EMROLD仅在280290nm处呈弱吸收。MALs的叔胺基团可与酸形成盐,其盐溶于水,羟基可被酰化成酯,酮基或醛基能与羰基试剂反应。MALs的盐或酯较游离形式稳定。
MALs结构中含有苷羟基、醛基、氨基等还原性基团,可与斐林试剂、茴香醛硫酸试剂、9-羟基呫吨盐酸醋酸试剂发生显色反应,亦可用于建立电化学检测方法。
MALs主要为脂溶性分子,易溶于甲醇,在酸性条件下不稳定。MALs为弱碱,pKa7.49.2

2 药理与代谢
MALs的抗菌作用机制在于干扰菌体蛋白的合成,与敏感菌的核糖体50S亚基结合,作用于P位结合点,抑制转肽酶的催化功能,阻碍mRNA的位移,使肽键不能从A位点转移到P位点,阻碍肽链的生成与延长,从而产生抑菌作用。在一般浓度下主要具有抑菌作用,高浓度时则呈现杀菌作用。MALs的抗菌谱主要为革兰氏阳性菌及某些革兰氏阴性球菌,包括葡萄球菌、粪链球菌、脑膜炎球菌、炭疽杆菌、淋球菌、白喉杆菌、百日咳杆菌、产气梭状芽孢杆菌、布鲁氏菌、弯曲杆菌、钩端螺旋体、肺炎支原体、立克次氏体和衣原体等。
MALs属中谱抗生素,对革兰氏阳性菌和支原体具有突出的抗菌活性,对螺旋体、立克次氏体和支原体亦有效。其中ERM对革兰氏阳性菌作用最强,TYL对支原体作用最强。临床上MALs主要用于治疗敏感菌引起的呼吸道、消化道和泌尿生殖道感染,如肺炎、细菌性肠炎、产后感染、乳腺炎等,肌内注射剂量一般为250mg/kgMALs毒性较低,如小鼠静脉注射LD50150650mg/kg,经口LD5015008000mg/kg。食品中MALs残留的主要问题是引起过敏和耐药菌株的扩散。
TILTYL作为畜禽专用药物,在兽医上被广泛使用,这两种药物在奶牛、奶山羊、绵羊、猪、鸡等动物体内的药动学研究已有报道。Thompson等报道了TIL在拌料给药时猪体内的浓度,按200mg/kg100mg/kg添加饲料,连续给药14d后肺组织中药物浓度分别为0.731.43μg/mL1.112.59μg/mL。山羊肌内注射TYL15mg/kg)的药动学参数:分布半衰期182h,总清除率6.8mL/kgmin),消除半衰期为3.04hcmax2.38pg/mL,生物利用度为72.6%
3 国内外限量要求
MALs残留监控中一般选择肝脏作为靶组织,原型药物为残留标志物,如TYLTILERMOLD等,个别药物(如SPM)需同时测定代谢产物。近年来,食品安全问题越来越引起人们的广泛关注,欧盟、中国、美国、加拿大、FAOWHO等已制定出动物源性食品中MALsMRL(表5-7)。
4 样品处理方法
样品基质中MALs处理方法包括提取、净化、浓缩。固相萃取(SPE)、液液萃取(LLE)是最为常用的方法,而加压液体萃取(PLE)、固相微萃取(SPME)、基质固相分散(MSPD)也有使用。提取方法主要视所研究的单个MALs和(或)样品基质而定。
4.1 提取方法
乙腈和甲醇是组织中MALs常用的提取溶剂。乙腈不但对多数药物具有相当高的溶解性,并且具有很强的除蛋白质、组织渗透能力和相当的脱脂作用,特别是含水的乙腈对脂肪溶解性差。样品用乙腈或甲醇提取,样品液经正己烷洗涤脱脂,再进行LLESPE净化,已成为提取和净化包括MALs等大多数药物残留的基本方法。
MALs呈弱碱性,微溶于水。在水溶液状态下一般易被分解,尤其在酸性条件下更不稳定。MALs溶于甲醇,具有单或共价双键,疏水性。可用乙腈、缓冲液、甲醇、乙腈缓冲液从碱性基质中提取。常用的提取溶剂有Tris缓冲溶液、偏磷酸甲醇、MCI-Vaine-EDTA缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液和甲醇等。
近年来,有报道检测蜂蜜中MALs残留。Benetti等用Tris缓冲液提取蜂蜜中5MALs和林可霉素,用HLB净化、LC-MS/MS检测。Thompson等调查了给药治疗的蜜蜂所酿蜂蜜中泰乐菌素残留分布。研究显示泰乐菌素A降解产生抗菌活性降解产物泰乐菌素B(即泰乐霉素)。WangLeung建立了一种检测鸡蛋、蜂蜜和牛奶中7MALs残留的LC-MS/MS分析方法。从生物样品中提取抗生素时常常需要去除蛋白质,同时要保证分析物较高的回收率。GarciaMayor等用磷酸液缓冲液和乙腈沉淀蛋白质后,检测牛奶中MALs
动物组织与鱼体内MALs残留检测方法也有很多报道。Bogialli等建立了牛奶、奶酪中6MALs检测方法,将样品用沙分散,热水提取。Berrada等比较了用EDTA-Mcilvane缓冲液和PLE提取肝脏和肾脏中MALs的提取效果。Horie等用02%偏磷酸甲醇(6:4V/V100mL)提取肌肉、鱼肉中9MALs残留物。

4.2 净化方法
目前生物基质的净化方法主要包括液液萃取、固相萃取、基质分散固相萃取、液液萃取结合固相萃取。对于生物组织样品,脂肪、蛋白质等杂质是主要的干扰物质,有效地去除脂肪不但能够提高方法的灵敏度,还能延长仪器和色谱柱的寿命。采用单一的液液萃取方法处理样品,检测结果背景干扰大、低浓度下回收率低,容易产生假阳性。而固相萃取既可用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的提取,又可用于净化、浓缩或富集,是目前兽药残留分析样品前处理中的主流技术。
4.2.1 液萃取
复杂基质中MALs可用液液萃取(LLE)提取、净化。支撑液膜(supported liquid membraneSLM)也可用来提取和(或)富集药物。液膜支撑体主要采用惰性多孔膜,液膜溶液借助微孔的毛细管力含浸于孔内。有机液体渗入聚合物支持层的小孔内,依靠毛细管力产生作用。如果有机液体与水溶性饲料混溶,可用来分离双水相。SLM的优势之一是膜内有机成分相对较少,可同时萃取与反萃取,产生较高的分离因子,易扩大规模,能量需求较低,整个运行成本低。肾脏和肝脏组织中MALsSLM提取方法已有报道,SLM提取后检测到的酒石酸泰乐菌素、ERMSPM的浓度水平分别为0.01μg/kg0.03μg/kg0.08μg/kg
鼠血浆中MALs及其衍生物的分析检测,样品用有机溶剂涡动混匀,碳酸钠调节pH,乙酸乙酯异丙醇提取,LC-MS检测,回收率为58%76%
4.2.2 固相萃取
固相萃取(SPE)可进一步除去样品中的杂质干扰,减少基质效应,同时可以对分析物进行浓缩,提高灵敏度。从食品基质中提取的MALs常用的SPE柱有HLBStrata-XBondElutC18BondElutdiolBondElutSCX等。OasisHLB吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物。其保留机理为反相,通过一个“特殊的极性捕获基团”来增加对极性物质的保留,提供很好的水浸润性,对极性或非极性、酸性、中性和碱性药物具有很好的保留和较高的重现性。Strata-XSPE柱功能与HLB相似,保留MALs能力较强。MALsHLB柱上吸附较好,40%甲醇即可洗脱下来,而没有明显损失。
用乙腈或pH8.0磷酸盐缓冲液提取鸡蛋、蜂蜜和牛奶中6MALsSPE净化,各MALs在其稀释浓度水平上回收率均超过88%Berrada等利用OasisHLB柱提取肝脏和肾脏中7MALs,在200μg/kg浓度水平,大多数药物的回收率大于67%,饲料中6MALs的回收率为74%107%。利用硅胶SPE柱净化,提取的两种MALs回收率很低,仅为40%55%
SCX是一种硅胶基苯丙磺酸填料,兼有阳离子交换和疏水作用机制。根据MALs的弱碱性和脂溶性,可利用SCX柱净化猪组织中泰乐菌素,方法的检测限可达到MRL
4.2.3 基质固相分散
基质固相分散(MSPD)是一种样品前处理方法,被广泛地应用于土质、半土质和食品中分析物的提取与净化中。MSPD可同时完成提取与净化,分析速度快,溶剂使用量少。
MALs利用热水作为提取溶剂进行MSPD提取,尽管存在基质效应,但这种方法仍是可行的,基质效应并未对方法的准确度产生显著影响。将牛奶和酸奶样品与沙土混合,将MSPD洗脱下来的目标分析物通过5mL30mmol/L甲酸水溶液,加热到70℃。调节pH后过滤,将200μL水相提取液直接进样。热水是一种有效的提取介质,牛奶和酸奶中分析物的回收率分别为68%86%82%96%
4.2.4 加压液体萃取
加压液体萃取(PLE)采用溶剂做流体,在高温(50200℃)、高压(1034213790kPa)下提取样品。Jiménez等对鸡蛋样品中TYLSPMERMJOSTIL进行检测,用含有150mg/gEDTA硅藻土混匀,乙腈-0.01mol/L pH6.0琥珀酸(11V/V)组成提取缓冲液,用ASE200萃取仪提取,LC-MS/MS分析,方法回收率为79%145%。检测限(CCα)为0.6216.8μg/kg,定量限(CCβ)为1.3233.6μg/kgAuroreBoscher等用甲醇乙腈-pH4.6 McIlvaine缓冲液(37.5:37.5:25V/V/V),含有0.3%EDTA-Na20.5mol/L)混匀后,用PLE提取饲料中SPMTILTYL,方法检出限可达4.96.5μg/kg
5 测定方法
各种基质中MALs残留检测的分析方法包括液相色谱紫外检测(LC-UV)、液相色谱荧光检测(LC-FLD)、电化学检测、LC-MSLC-MS/MSTLC和毛细管电泳(CE)等。
5.1 高效液相色谱(HPLC)分析法
MALs难以汽化,并且多数具有强的UV吸收,HPLC-UVMALs残留的主要测定方法。MALs含有碱性的叔胺基团,在硅胶固定相中易发生峰拖尾,影响分离。所以绝大多数MALs测定中使用高纯硅胶为基体,并将经端基封闭处理的C18C8填料作为固定相,流动相成分较为复杂。SPMTYLTIL共价双键形成的发色基团在232287nm波长处有好的吸收,可用UVD进行检测。然而,ERM及其半合成衍生物包括AZMCLAROM没有共价双键键合到内酯环,故利用UV进行检测时吸收较少,痕量水平几乎检测不到,且在210215nm波长处检测此类药物残留,该波长处很多物质被吸收干扰其检测。为了提高灵敏度,采用FLD检测ERMAZMCLA等,需要进行化学衍生化。
MALs的色谱分离主要使用反相色谱柱。大多数研究使用传统的C18键合硅胶固定相,近年来,带有2μm颗粒填料的C18色谱柱的UPLC或其他快速色谱分离系统成为一种新的分离技术,在分析化学领域大受欢迎。特别是与MS串联,能够快速采集数据,在药物分离、速度、灵敏度方面具有显著优势。流动相组成、浓度和pHMALs最佳离子化和色谱分离的关键。乙腈和甲醇是色谱分离最常用的有机溶剂。0.1%甲酸、1020mmol/L醋乙铵常被用来作为流动相修饰剂。而且0.04%七氟丁酸、0.02%0.1%三氟乙酸、1mmol/L九氟戊酸是疏水性的离子对试剂,可用来改善色谱峰形,增加MALs的保留。然而,离子对试剂会引起ESI离子抑制,使响应信号明显降低,尤其是那些含有氮原子的药物。因此如果可能的话,尽量避免使用离子对试剂,以提高MALs痕量检测的灵敏度。
有关生物样品中MALsHPLC分析法很多,但涉及组织中MALs残留的方法较少。从2001年至今已报道的MALs残留的HPLC分析法见表5-8
5.2 色质联用分析法
5.2.1 GC-MS
GC-MS分析样品基质时,衍生化过程较为繁琐,在残留分析中应用受到限制。Takatsuki等建立了组织中ERMOLDSPMKITTYLGC-MS确证方法,所需的样品处理步骤(包括一系列衍生化过程)相当复杂。MALs相对分子质量大,并且含有氨基、羟基、羰基等极性基团,需衍生化后才能进行GC-MS分析。肌肉样品经甲醇提取、正己烷脱脂和硅胶SPE柱净化后在0.3mol/L盐酸中水解脱去中性糖链,生成仅含有碱性糖链的水解产物,即红霉糖胺、desoleandomycinforocidineO-mycaminosyltylonolide,其中,SPMKTT会产生相同的化合物forocidine,因此该方法无法区分这两种药物。水解碱性糖链的条件会导致内酯环开裂。将水解产物在乙酸酐/吡啶中酰化,生成相应的醋酸酯。结构中含有碳碳双键的物质(SPMKITTYL的衍生物)尚须首先用氢气/铂氢化后再进行水解和酰化。上述衍生化目的在于降低待测物的相对分子质量和极性,使其适宜进行GC分离。硅胶柱净化和衍生物氢化对测定是必需的,前者能除去在GC分离中与待测物几乎同时流出的干扰杂质,后者能减弱色谱柱对待测物的保留、改善峰形。使用乙酸酐酰化较硅烷化得到的衍生物相对分子质量较小,可提高质谱检测的灵敏度。

5.2.2 LC-MS
MALs是一类含有氮原子的分子,在电喷雾离子源正离子(ESI)模式下,易于质子化形成单电荷、双电荷、三电荷的分子离子。ERMCLATYLNYSA1、两性霉素B均含有1个氮原子,形成[MH]峰。AZMSPM、新螺旋霉素、TILROM含有2个氮原子,形成[MH][M2H]2峰。TUL含有3个氮原子,可形成[MH][M2H] 2[M3H] 3峰。带电荷多少与MALs中含有的氮原子数相关。单或双电荷离子均用来采集数据。
LC-MS接口最常用的两种离子化技术是ESIAPCIESI适用于极性和中等极性药物,涵盖质量范围较宽,因此已经变成LC-MS接口的“金标”。尽管APCI源基质效应小,但是ESI已经成为LC-MS分析不同类型基质中MALs的主要接口技术。APPI是一种较新的离子化技术。APPIAPCIESI的良好替代和互补的离子化技术。APPI形成带电粒子的基本原则是光离子化、质子跃迁、电荷转变。APPI具有同APCI相似的离子化范围,可以扩大低极性化合物的离子化范围,因此与ESIAPCI源相比,常用来电离非极性化合物。尽管APPI较少应用于分析MALs,但已经显示出在减少基质效应方面的优势,希望将来较多地应用于MALs的分析。2001年至今,已有大量用LC-MS法测定食品基质中MALs残留的文献(表5-9)。
基质效应是LC-MS定量分析的挑战,尤其是ESI作为接口技术时。基质可能增强或抑制分析物的离子化,而这种影响视不同基质而定。基质效应可通过基质中比较分析物在溶剂或缓冲液中的响应进行评价或测定。利用同位素标记的内标、基质添加标准曲线、标准添加法等是减少基质效应的应对方法,可以提高检测方法的准确度。其中标准添加法较为繁琐。另外由于缺少氘代标记的内标,一般运用基质添加标准曲线、化学类似物如ROM作为内标,达到减少基质效应的目的,来进行MALs残留的定量分析。
LC-ESI-MS已经成功用于检测鸡肉中残留的7MALs。在选择离子扫描(SIM)模式下,质子化的分子离子可用来定量。已经报道的方法的检测限为120μg/L。检测肉和鱼组织样品中8MALs的定量限(LOQ)可达到10μg/kg,总离子流和提取离子流的色谱图见图5-92001年,Draisci等报道了一种micro-LC-MS/MS方法检测牛组织中3MALs。方法使用APCI作为离子源,TIL分子离子峰为[M2H]2m/z435ERM[MH]m/z734TYL[MH]m/z918。每种化合物选择2个子离子达到确证分析的要求。肾脏、肝脏和肌肉的LOQ20150μg/kg
5.3 毛细管电泳(CE
CE作为一种分离手段,其分离效率高,可同时分离成百上千种成分,仅需要很少量的样品和试剂。然而CE所需进样体积小、检测波长短,检测残留痕量水平的药物残留,其检测灵敏度低。Zhang等建立了单分散甲基丙烯酸缩水甘油酯二乙烯基苯聚合微球,季铵/十八烷基基团衍生化产生正相电荷的固定相,45%乙腈-10%EtOH-30mmol/L pH8.0磷酸盐缓冲液作为流动相,15kV电压下利用CE分离MALs。同时也可将ERMA与其他杂质分离,图5-10的电泳条件为阳离子柱30cm(有效长度20cm)×350mm,流动相:25%乙腈∶25%乙醇∶30mmol/L pH8.0磷酸盐缓冲液,电压21.5kV,检测波长206nm;图5-11的电泳条件为阳离子柱30cm(有效长度20cm)×350mm;流动相:45%乙腈∶10%乙醇∶30mmol/L pH8.0磷酸盐缓冲液,电压21.5kV,检测波长206nm。童敬首次建立了同时检测饲料中替米考星、泰乐菌素、四环素、土霉素和多西环素的HPCE-DAD方法。配合饲料的电泳条件为长度64.5cm、内径75μm的拓展光程毛细管,20mmol/L柠檬酸-40mmol/L磷酸氢钠分离缓冲液(pH2.65),30kV分离电压,5种药物分离完全,定量限≤2mg/kg;预混料中5种药物的分离条件为长度64.5cm、内径75μm的拓展光程毛细管,20mmol/L柠檬酸-40mmol/L磷酸氢钠分离缓冲液(pH2.73),25kV分离电压,5种药物分离完全,定量限≤4mg/kg。添加回收试验5种药物的平均回收率为70%105.1%,变异系数<9.3% 

5.4 薄层色谱法(TLC
TLC是用薄层板将样品提取液中被测物展开分离后,测定样品与标准品吸收光或采用发射光薄层扫描法测定。它设备简单,检验成本低,操作简便快速,通过变换不同的显色剂和检测方法可用于大量样品的测定,特别适用于无紫外吸收的杂质的检测,所以在2000版《中华人民共和国药典》中,所有相关MALs的检测都采用该法。但该法在MALs残留分析资料中很少出现。多数采用硅胶做吸附剂,展开剂中常加入适量小分子有机酸以防止斑点拖尾。
5.5 免疫测定法
Beier等研究了TIL单克隆抗体的制备及特性。采用不同的方法合成偶联物(图5-12)。钥孔血蓝蛋白(KLH)和BSA分别作为免疫原和包被原。分离与TIL竞争而产生单克隆抗体的6株杂交瘤细胞,TIL-1TIL-5单克隆抗体IC50分别为9.6ng/孔、6.4ng/孔(48ng/mL32ng/mL)。IC20的检测限分别为1.84ng/孔、0.89ng/孔(9.2ng/mL4.45ng/mL)。这种单克隆抗体证实对含有C20位具有35-二甲基哌啶和C5位氨基糖的MALs交叉反应性较高。对于不含有35-二甲基哌啶的TYL和其他MALs则不具有交叉反应性。
Draisci等采用鼠单克隆抗体建立了检测牛肉中ERMTYL残留的电化学酶联免疫法。该法用ERMTYL-BSA偶联物作为包被原,ERM的检测限为0.4ng/mLTYL的检测限为4.0ng/mL。同时采用了micro-LC-MS/MS对样品进行了方法确证。


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《动物源性食品安全危害及检测技术》是一本实用的专业技术参考书,可为国内广大动物源性食品安全检测领域技术人员提供参考资料。全书共包括七部分内容,第一部分介绍了动物源性食品安全的基本概念、危害因素以及检测技术概况;第二部分至第七部分分别针对动物源性食品中主要危害因素,如细菌、寄生虫、霉菌毒素药残留、农药残留、污染物等,对其相关检测技术进行了详细介绍,并列举了多种检测方法应用实例,具有很强的实用性和指导性,对一线检验检测人员的工作具有很好的指导作用。


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作者:曲志娜 赵思俊等

公众号:中国兽医发布

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发布时间:2021-07-23 17:13:06

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