/ 中国兽医发布_动物源性食品中兽药残留的检测——酰胺醇类药物残留

中国兽医发布_动物源性食品中兽药残留的检测——酰胺醇类药物残留

由曲志娜 赵思俊等发表于2021-07-22 18:50:51

酰胺醇类药物(amphenicolsAPs)属广谱抗生素,主要包括氯霉素(chloramphenicolCAP)、甲砜霉素(thiamphenicolTAP)和氟苯尼考(氟甲砜霉素)(florfenicolFF)。

CAP是从委内瑞拉链霉菌(Streptomycesvenezuelae)培养液中提取获得的,是第一个可人工合成的抗生素,化学名为D-苏式-1-对硝基苯基-2-二氯乙酰氨基-13-丙二醇。由于CAP可引起人和动物的可逆性血细胞减少和不可逆的再生障碍性贫血,目前世界各国几乎都禁止将CAP用于所有食品动物。将CAP分子中的对位硝基用甲磺酰基取代制成TAP,毒性明显降低,但美国等发达国家也已禁止在食品动物上使用CAPFFTAP的单氟衍生物,是20世纪80年代后期由美国Schering-Plough公司开发的抗菌谱更广、活力更强的动物专用广谱抗生素。FF与同类药物CAPTAP相比,具有抗菌活性高、无潜在致再生障碍性贫血等优点,已成为CAP禁用后的主要替代药物,在兽医临床上发挥着重要作用。本部分综述了APs的结构与性质、药理、毒理与危害、国内外限量要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容,以期为该类药物的全面了解和残留检测提供参考。

1 结构与性质

APs的化学结构式见图5-1




APs的理化性质见表5-1



2 药理特性

2.1 抗菌机理

本类药物的作用机理主要表现在与70S核蛋白的50S亚基上的A为紧密结合,阻碍肽酰转移酶的转肽反应,使肽链不能延伸,而抑制细菌蛋白质的合成。

2.2 抗菌活性

CAP为广谱抑菌性抗生素,对革兰氏阳性菌和阴性菌都有作用,但对革兰氏阴性菌的作用较阳性菌强。对其敏感的革兰氏阴性菌有大肠杆菌、沙氏门菌、产气杆菌、布鲁氏菌、巴氏杆菌等,革兰氏阳性菌有炭疽杆菌、肺炎球菌、链球菌及葡萄球菌等。CAP对伤寒杆菌和副伤寒杆菌有显著疗效,为临床首选药物。CAP对少数衣原体、立克次氏体和某些原虫也有一定疗效,但对绿脓杆菌、真菌、病毒不敏感。

TAP的抗菌谱与CAP基本相似,对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎杆菌等作用较CAP略差。由于TAP在肝内不易被代谢失活,血中游离型TAP浓度较高,因此该药在体内呈现较强的抗菌活力,其保护作用可超过CAP

FF属动物专用广谱抗生素,抗菌活性及抗菌谱均优于CAPTAP,对多种革兰氏阳性菌和阴性菌以及支原体等都有作用。

2.3 药动学研究

CAP在各种水产动物体内的药动学研究有诸多报道。Nouws等报道了CAP在鲤和鳟体内的药动学研究,CAP消除半衰期分别为鲤10.5h和鳟10.4h。刘秀红等采用高效液相色谱法测定牙鲆体内CAP的药物浓度,利用非房室模型统计矩原理分析药动学数据。结果表明:①单次口服剂量为80mg/kgCAP,药物在牙鲆体内的血药浓度时间曲线呈明显双峰现象,第一次达峰时间Tmax出现在2.00h,鳃、肝、肾、血、肌的第一次达峰浓度cmax依次为15.01μg/mL11.80μg/mL10.35μg/mL8.56μg/mL5.21μg/mL;第二次达峰浓度cmax小于第一次的浓度,第二次达峰的时间Tmax出现在8.00h。血药浓度时间曲线下面积(AUC:肾、鳃、肝、血、肌分别为176.87μg/mL·h)、133.77μg/mL·h)、118.77μg/mL·h)、65.33μg/mL·h)、50.36μg/mL·h)。CAP消除半衰期(T1/2)为4.8910.39h,平均滞留时间为8.6717.05h,说明CAP在牙鲆体内吸收较迅速,但滞留时间较长。②连续5d口服剂量为40mg/kgCAPCAP消除半衰期(T1/2)为39.40115.50h,说明口服CAP在牙鲆体内消除缓慢,残留较严重,其中以肾脏和肝脏组织中残留最明显。

TAP在动物体内的药动学研究国内外均有较多报道。Aabdennebi等通过静脉注射、肌内注射、口服三种途径给绵羊投药,结果发现肌内注射和静脉注射药物吸收速度较口服给药吸收快,而且给药早期血浆浓度也相应较高;而口服给药时药物是通过胃肠道吸收,血药浓度较低,但维持时间较长,至少维持24h。杨洪波等通过单剂量口灌给药,采用LC-MS/MS法研究了TAP在鲫和松浦镜鲤体内的药动学。TAP在鲫和松浦镜鲤体内吸收分布迅速,均符合一级吸收二室开放模型,但消除缓慢。

TAP在鲫血浆、肝脏、肾脏和肌肉中的分布半衰期(T1/2α)分别为1.446h1.958h7.410h1.376h,消除半衰期(T1/2β)分别为16.712h21.267h79.970h25.600hTAP在松浦镜鲤血浆、肝胰脏、肾脏和肌肉中的消除半衰期(T1/2β)分别为77.292h24.625h79.966h25.600h;分布半衰期(T1/2α)分别为7.317h0.454h7.409h1.376h。鉴于TAP在鲫和松浦镜鲤肾脏中的消除半衰期长、消除缓慢,建议使用该类药物时相对延长给药间隔时间。

畜禽内服和肌内注射FF后,FF吸收快,在畜禽体内分布较广,半衰期长,能维持较长时间的血药浓度。Horsberg等用14C标记的FF研究其在鱼体内的药动学,结果显示放射性物质的消除主要经过尿路和胆汁两条途径,FF在大西洋鲑体内代谢快,FFA是其主要的代谢产物。FF在鼠体内的代谢产物为氟苯尼考醇、氟苯尼考胺、氟苯尼考草酸、单氯氟苯尼考和氟苯尼考胺的葡萄糖醛酸化合物。FF代谢与水解产物的关系如图5-2所示。


朱师等用300尾健康鲫,按单剂量(40mg/kg)经肌内注射和口服FF,以反相高效液相色谱法(RP-HPLC)为检测手段,采用WINNONLIN药动学计算机程序处理血药浓度时间数据,分析结果表明:鲫单剂量肌内注射和口服FF后,血药浓度时间过程均符合一级吸收二室开放模型,FF经肌内注射和口服后在鲫体内具有吸收较快、达峰时间短、体内分布广泛等特点。两种给药途径的血药达峰时间相近,但峰浓度差异较大(口服为肌内注射的近2倍),吸收均较快,但肌内注射消除速度缓慢而口服的消除速度相对较快,肌内注射分布更广泛。岳刚毅等对克氏原螯虾体内药动学进行了研究,按50mg/kg剂量单次口灌FF表明,FF在肝胰脏中消除半衰期为16.9h,低于其在肌肉中的消除半衰期21hFFA在两组织中的消除速率相差不大。肝胰脏中残留标志物(FFFFA之和)的含量高,消除速度慢,是残留检测的靶组织。王瑞雪等对FF在西伯利亚鲟体内的药动学研究表明,FFFFA在各组织中的分布规律相似,均先在肝、肾中富集,FF在组织中的含量由高到低依次为肝脏、肾脏、肌肉,FFA的含量由高到低依次为肾脏、肝脏、肌肉;FFFFA均在肾脏中消除速度最为缓慢且FFA的消除速度明显慢于FF,且在西伯利亚鲟体内FF主要以原型药物形式消除。

3 毒理及危害

在过去的几十年里,CAPTAP在兽医临床抗感染的治疗中发挥了重要作用,但近年来,随着公众对其潜在毒性、残留和耐药性的广泛关注,许多国家陆续禁止了它们在兽医临床上的使用,取而代之的是新型酰胺醇类抗生素FFFF主要用于治疗牛、猪、鸡和鱼类的细菌性疾病,如巴氏杆菌引起的牛呼吸道感染、乳腺炎;猪传染性胸膜肺炎、黄痢、白痢;鸡大肠杆菌病、禽霍乱;鱼疖病等。

3.1 毒理

APs抗菌谱广,抗菌作用强,但该类药物毒副作用也较大,CAP主要抑制人的造血功能;TAP主要抑制人的免疫功能,毒性作用均较大:而FF毒性作用较小,主要对动物胚胎有毒性作用。

CAP对骨髓造血机能有抑制作用,可引起血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血等。其骨髓毒性分为两类:一类是可逆性抑制,主要影响红细胞、白细胞和血小板的形成;另一类是再生障碍性贫血。前者具有剂量依赖性;后者少见,与剂量无直接关系,其后果极为严重且不可逆转。CAP对新生儿、肝肾功能不全的病人及老年人的影响更大。近年来,就有儿童服用多量CAP和老年妇女使用CAP眼药膏导致死亡事件的报道。此外,CAP还能引起腹胀、腹泻等胃肠道症状,口腔黏膜充血、口角炎等口部症状,视神经炎、神经性耳聋,以及中毒性精神病的其他不良反应。

TAP的主要不良反应与CAP相同,即对造血功能的毒性较大,早期可发生血清铁增加,白细胞、血红蛋白及网织细胞减少,停药数日可逐渐恢复,程度比CAP轻;不产生再生障碍性贫血,有比CAP5倍的免疫抑制作用;尚有腹泻、胃烧灼感、恶心、呕吐、腹痛等胃肠道反应,未见致死的再生障碍性贫血和灰婴综合征报道。

CAP中芳香环上对位硝基是引起再生障碍性贫血的主要基团。FF在结构上以甲磺酰基(-SO2CH3)基团取代了硝基(-NO2)基团,用药后不再引起再生障碍性贫血的不良反应。因此FF替代CAP已广泛用于动物感染性疾病的防治。在特殊毒性方面,FF无致畸、致癌、致突变作用。FF不会引起染色体结构或数量上的畸变;在急性或亚急性给药条件下,不会诱发骨髓细胞染色体畸变;通过微核试验,也未发现致突变作用。但繁殖毒性试验表明它有胚胎毒性,故妊娠动物禁用。

3.2 危害(耐药和残留问题)

细菌对CAPTAP产生耐药性的机制已较为清楚。一种是通过CAT基因调控合成乙酰转移酶使CAPTAP转化为无抗菌活性的代谢产物;另一种机制与cmIA基因有关,在该基因的调控下,菌体通过泵出机制使药物在菌体内聚集减少。与CAPTAP相比,FF结构的修饰及改造使其在安全性和有效性方面具有明显的优势。FF在结构上以氟原子取代了CAPTAP中丙烷链3碳位置上的羟基,阻止了细菌乙酰转移酶在此位置上的乙酰化作用,故不受该酶影响而免被灭活。因此细菌对FF不会产生类似CAPTAP由质粒介导所产生的耐药性,许多对CAPTAP呈耐药的菌株仍对FF敏感。

但是随着用药量的增多,临床上对FF耐药的细菌也已开始出现。有研究表明,FF的耐药性与floR耐药基因出现有关,并与CAP存在不完全的交叉耐药。

Kim等于1996年首次从鱼的巴氏杆菌质粒中发现耐FF的基因并克隆测序将其命名为pp-flo。随后,BoltonArcangioli相继从沙门氏菌、大肠杆菌中克隆得到耐FF的耐药基因floR,其序列分析表明,其与cmIA基因同源性达50%。从牛致病性大肠杆菌中分离的floR基因的承载质粒被命名为pCCK381,从猪致病性大肠杆菌中分离出的floR基因的承载质粒被命名为pMBSF1。质粒pMBSF1是目前分离的携带floR基因的最小质粒,其floR区域与从牛大肠杆菌中分离的不同。研究表明此质粒具有染色体整合位点,进一步分析显示,floR基因是泵出蛋白MF超家族的一员。泵出机制是细菌继酶机制和靶位点改变的另一类重要耐药机制,近年来日益受到微生物界的重视。

有研究从被感染小牛的鼻腔液中分离出一种编码抵抗CAPFF的新型缓慢葡萄球菌基因fexA,携带此基因的质粒被命名为pSCFS2。分析表明,fexA基因的上游区域与CAP诱导的葡萄球菌属CAT基因和cmIA基因具有显著的同源性。研究表明FexA蛋白代表一种非常典型的FF/CAP输出系统,但它与floR蛋白子群和cmIA蛋白子群有明显的不同。

但是,相比其他类药物,酰胺醇类药物由于有良好的抗菌和药理特性,特别是TAPFF不易产生耐药,与同类药物之间不容易形成交叉耐药,很多对CAP产生耐药的菌株对这两种药物仍然敏感等,因此该类药物仍然是畜牧及水产养殖病害防治的常用药物。但是由于乱用及滥用,该类药物的残留问题日趋彰显。

4 国内外限量要求

自我国加入WTO以来,动物源性食品中药物残留问题已经成为国际贸易壁垒中新的技术壁垒。其中影响最大的是2002年我国与欧盟之间的“CAP事件”。2002128日,欧盟以虾中存在CAP残留为由宣布全面禁止从我国进口动物源性食品,这使我国的水产品对欧盟出口受到严重的挫折。该禁令封杀了我国每年约7亿美元相关产品的出口。该事件之后,美国、日本、欧盟等国家通过不断降低该类药物的MRL和检测限制造新的技术壁垒。表5-2是我国对TAPFF在动物组织中的MRL


5 样品前处理技术

样品前处理技术一般包括提取、净化、浓缩富集和衍生化等。优化前处理技术不仅可以提高工作效率,还可以提高方法的灵敏度。动物源性食品中药物残留的样品主要涉及各种组织、牛奶、血液和尿样等,尤其是组织样品基质复杂,前处理过程更是比较繁琐。组织样品前处理前需要先将组织样品捣碎和均质,有的组织样还需要加酶处理。在肝脏中,CAP快速代谢成葡萄糖醛酸轭合物。Markin发现,在-20℃储存条件下,切成薄片的肝和肾中CAP发生了降解,而切成块状的样品则保持稳定。在猪的肝肾组织中,一半以上的CAP以轭合物存在,其葡萄糖醛酸轭合物可以用β葡萄糖醛酸苷酶水解后测定,与原型药一起分析。血浆样品一般需要抗凝处理,后经离心取血清。

5.1 提取

样品提取的方法主要是液液分配法。根据“相似相溶”原理,食品中APs提取有很多报道,一般选取甲醇、丙酮、乙腈和乙酸乙酯等,其中以后两种化学试剂较为常用。有研究比较了乙腈、乙酸乙酯、乙酸乙酯乙腈、乙酸乙酯氨水和碱性乙酸乙酯乙腈对水产品中CAPTAPFFFFA4种物质的提取效果,结果表明碱性乙酸乙酯乙腈提取效果最好。

5.2 净化

APs提取液的净化一般为液液萃取和固相萃取(SPE),且以两者联合使用较为常见。为除去脂类,常用正己烷、石油醚或异辛烷,其中正己烷最为常用。液液分配后通常需要SPE做进一步的净化。常用的SPE柱有:氧化铝柱、Florisil柱、PSA柱、Oasis MCX SPE柱、Oasis HLB反相SPE柱、硅胶柱和C18柱等。

有研究表明在水溶液中加入氯化钠,有机溶剂能有效地把该类药物反萃取出来。表5-3表明,在水溶液中加入氯化钠的浓度不宜太高,氯化钠的浓度通常为3%4%。方晓明证实在液液萃取中,加3%4%的氯化钠溶液可以提高乙酸乙酯对APs的萃取率,尤其是TAPFF

在净化过程中C18柱因回收率高而较常用。杨方等比较了正己烷脱脂净化、C18固相萃取小柱、填料为N-丙基乙二胺的PSA柱以及凝胶渗透色谱(GPC)柱对TAPFFFFA的净化效果。试验发现,单纯以正己烷去脂对复杂基体如烤鳗等样品的净化效果不甚理想;而C18柱对FFA没有净化作用;C18柱和PSA柱分别对TAPFFFFA有较好的净化效果,串联这两种柱子的净化效果与GPC净化结果相当。

串联进行样品净化可取得较好效果。Nagata等分别用Florisil柱和氧化铝柱净化了CAPTAPFF,结果显示Florisil柱不仅得到较高的回收率,而且更能有效地除去脂类干扰。

Liu等使用磁性微球等新技术净化牛奶样品中的CAP,通过优化磁性材料数量、pH、净化时间和温度等条件,在最优条件(100mg/g的磁性材料,pH510min20℃)下,该方法的灵敏度比无磁材料提高了10倍。

6 残留测定方法

APs药物残留分析方法主要包括三大类:微生物法、免疫分析法和色谱分析法。虽然微生物法操作简便、样品用量少、预处理简单,但其容易受组织中其他抗生素影响,且特异性低,灵敏度也不高,目前已难以满足残留分析要求。基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫学分析法灵敏度较高、特异性强、使用方便,适用于基层大规模的筛选工作,但是存在一定的假阳性,需要结合色谱分析法加以确证。国际公认的确证方法则仍是色谱分析法中的气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)。

6.1 微生物法

微生物法利用特定菌株与药物的作用来检测样品中抗生素的种类与含量。该方法曾广泛用于动物源性食品中兽药残留的初级筛选,但是该检测法灵敏度较差,检测限较高,已不能满足该类药物检测限不断降低的要求,但是对于高兽药残留的样品如饲料还是适用的。常用的方法有棉签法与杯碟法。

6.1.1 棉签法

棉签法又称现场拭子法,是检测动物体中抗生素残留的现场试验方法。该方法是用棉签(拭子)采取动物体内的组织液,然后将其放置于涂满枯草杆菌的培养基中保温过夜。以拭子周围出现抑菌环及抑菌环的大小来判断检测结果。

6.1.2 杯碟法

杯碟法是样品经处理后,注入牛津杯中,与含菌液的检定平板贴合,培养后,根据抑菌圈有无及大小判定结果。该方法的灵敏度较棉签法高,能在一定程度上排除其他抗生素的干扰。Shakila等采用该方法用Photobacterm leiognathiL2-strain)检测虾中CAP残留,检出限为1ng/g。但此法操作繁琐。

6.2 免疫分析法

免疫分析法是一种以抗原抗体特异性结合为基础的分析方法,该方法选择性好、灵敏度高。主要包括ELISA、放射性免疫法(RIA)等,目前广泛使用的是ELISA,其具有操作简便、灵敏度高、样品容量大、仪器化程度高和分析成本低的优点,是目前最理想的残留筛选性分析方法之一。

6.2.1 全抗原合成及抗体制备

APs属于小分子化合物,不能诱导机体的免疫反应。使用免疫分析法的前提是获得抗APs抗体。1966年,Hamburger首次制备了抗CAP抗体。CAP的二氯酰胺醇和硝基苯结构均可以作为抗原决定簇,其中二氯酰胺醇结构(特别是氯原子)对抗体的选择性具有重要影响。

一般采用琥珀酸氯霉素(氯霉素半琥珀酰酸酯)作为免疫半抗原制备完全抗原。其反应过程见图5-3;也可以通过硝基端将半抗原与载体蛋白连接,其反应过程见图5-4

Hamburger等研究了上述两种结构的完全抗原对CAP抗体性能的影响,结果显示抗原Ⅰ诱导的抗体能够同时识别抗原Ⅰ和抗原Ⅱ,但是抗原Ⅱ诱导的抗体只能识别抗原Ⅱ。这说明抗原Ⅰ能够诱导针对CAP的二氯酰胺醇和硝基苯结构的抗体,或者说硝基的存在对CAP抗体的产生具有特殊作用。抗原Ⅰ和抗原Ⅱ诱导的抗体对CAP的亲和性相近,后者略高。随后,Hamburger等又制备出针对TAP的抗体。针对TAP完全抗原的合成,首先将TAP半琥珀酰酯化,后用混合酸酐法与载体蛋白偶联。其反应历程类似于CAP合成过程。有研究使用碳二亚胺法将FFA与载体蛋白偶联作为免疫抗原免疫动物诱导抗体产生。曾华金等采用琥珀酸酐将FF的羟基活化后制备出半抗原氟甲砜霉素半琥珀酸(FF-HS),后采用碳二亚胺法将FF-HS与牛血清白蛋白(BSA)偶联获得FF完全抗原。


完全抗原合成以后,分别免疫兔与小鼠,最终获得对应的多克隆抗体和单克隆抗体。相对于多克隆抗体,单克隆抗体具有更好的特异性,而且一旦获得单克隆抗体的细胞株,可以有稳定的抗体来源。

6.2.2 RIA

早在1984Arnold等建立了CAPRIA,并与气相色谱电子捕获器(GC/ECD)进行了比较。Arnold等合成了3H标记的N-丙酰类似物,该方法的检测限可达0.2μg/kg。两种方法测定结果表明RIA对肌肉组织和蛋的检测限高于GC/ECD,而对于牛奶则低于GC/ECD

另一种是由美国FDA推荐使用的CharmⅡ放射免疫分析系统,该系统的原理也是基于竞争性的抗原抗体反应,该系统根据检测限要求的不同,包括两种试剂盒方法,方法1适用于检测<10μg/kg和<5μg/kg的氯霉素残留;方法2适用于检测<0.3μg/kg的氯霉素残留。黄晓蓉等利用Charm7600放射免疫分析系统建立了烤鳗中CAP残留分析方法,对271份烤鳗进行分析并通过GC/MS确证,结果表明方法1的灵敏度较差,但不存在假阴性与假阳性;方法2的灵敏度较高,但是存在一定的假阳性。陈小雪等使用该系统测定了水产品中CAP残留,方法检测限为0.15μg/kg,在0.15μg/kg0.3μg/kg1μg/kg3个添加水平中,样品的每分钟脉冲数(counterperminutecpm,在液体闪烁计数仪[3H]频道进行60s计数)读数均落在相应控制点60%100%的范围内,cpm读数的相对标准偏差为2.4%8.8%

RIA用放射性同位素标记,制备简单、省时,但存在放射性同位素会污染环境的缺点,所以在生产实际中应用不多。

6.2.3 ELISA

ELISA应用酶作为标记物,专一性强,成本低,可避免放射性污染和标记物衰变,被普遍应用。

Campbell等将CAPKLH偶联作为免疫原、与BSA的偶联物作为包被原建立了多克隆抗体的间接竞争ELISA的检测方法,对得到的特异性抗体进行交叉反应试验,结果显示仅对琥珀酸氯霉素盐和TAP有交叉反应,方法检测限为1ng/mL,测定低浓度(<100ng/mL)残留的日间变异系数为2%3%,较高浓度(100500ng/mL)残留的日间变异系数为4%5%2006年,郝凯等研究了利用竞争性ELISA测定与定量TAP。以人工合成的TAP-鸡血清白蛋白(TAP-OVA)为包被抗原、TAP为竞争半抗原,两者与一定量的抗TAP多克隆抗体反应,建立了快速定量测定TAP残留的ELISATAP的最适检测范围为0100μg/L,检测限为0.1μg/LP0.05)。2010年刘智宏等将FFA与载体蛋白相连作为抗原免疫动物,获得抗TAPFF等药物的抗体,建立了水产品中TAPFFFFA残留的ELISA。结果显示3APs交叉反应率为30%156%,鱼和虾肌肉组织中的检测限分别为6.3μg/kg6.1μg/kg

总之,ELISA操作简便、灵敏,使得痕量残留分析成为普通实验室的常规技术,而且可以同时检测10个甚至上百个样品,是十分理想的大批量样品药物残留测定的快速筛选方法。目前可供选择的商品化专用试剂盒技术已经相当成熟,配合色谱法定量确证,避免了假阳性,同时简化了大量的检测工作,缩短了报告检测周期。

6.2.4 其他免疫方法

随着新技术的不断出现,免疫分析法得到进一步的发展,使APs残留检测的灵敏度大大提高。徐欢建立了快速检测食品中CAP残留的胶体金免疫层析方法,该方法利用改良竞争ELISA测定单克隆抗体与各抗生素的交叉反应,抗CAP单克隆抗体(CAP-McAb)与氯霉素琥珀酸钠有交叉反应,而与青霉素、链霉素、磺胺二甲嘧啶、TAP等抗生素无交叉反应,与各抗生素、类似物的交叉率均小于0.01%,具有较高的特异性和亲和力。制得的免疫层析试纸条检测已知的含有CAP的样品,灵敏度为100ng/mL,在其灵敏度范围内重现性为100%,试纸条在5min左右出现清晰的条带。

张启模等通过制备抗CAP单克隆抗体建立了其化学发光酶免疫方法,该方法的检测范围为0.00110μg/L,检测限达0.0025μg/LIC5039.6μg/L,且与L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、青霉素、四环素、庆大霉素等的交叉反应率均小于0.01%。何方洋等建立了CAP化学发光酶联免疫检测方法,该方法最佳检测范围为201620pg/mLIC5059.911pg/mL,检测限为9.3pg/g,可检出国际规定的CAP残留标准限量值以下的残留量。与常规ELISA相比,该方法不仅提高了检测限和灵敏度,而且反应时间缩短了60min

李因来等建立了磁珠标记的CAP直接竞争ELISA,该方法的检测灵敏度达到0.1μg/L。利用xMag?异硫氰酸根末端磁粒标记CAP单克隆抗体制备免疫磁珠,用该免疫磁珠富集样品中的CAP,经过乙酸乙酯抽提免疫磁珠表面吸附的CAP,再通过直接竞争酶联免疫吸附试验(cdELISA)检测,可使CAP检测灵敏度提高50倍,即达到0.002μg/L

6.3 色谱分析法

目前较普遍使用的色谱分析方法主要有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UPLC)、气相色谱质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)和超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)。

6.3.1 GC

GC是较早应用于APs残留检测的质谱分析方法。APs分子中含有极性较强的羟基、氨基、硫酰基和亚氨基等,这些基团具有高热稳定性和难挥发性,在运用GCGC/MS进行分析前,需要进行衍生化。衍生化一般有酯化、酰化和硅烷化,选择的衍生化反应要简单,能快速完成且少有副反应。硅烷化是测定APs最常用的衍生化方法,常用衍生试剂有NO-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA三甲基氯硅烷(TMCS)(体积比为991)、三甲基硅烷(TMS)、六甲基二硅氧烷和六甲基乙硅氧烷三甲基氯硅烷的吡啶溶液等。这些试剂衍生速度快,条件简单,产物的挥发性和热稳定性高,色谱峰形好。

APs除含有的卤素原子外,还含有如硝基、芳香甲硫酰基等电子亲和力强的基团,因此常配合使用电子捕获检测器(ECD),该检测器比氢火焰离子化检测器(FID)和热导池检测器(TCD)的灵敏度高,专一性好。

为了提高方法准确性,常使用一些与该类药物相似的化合物作为内标物,如CAP的光学异构体、间硝基CAPPCB-138等。如测定CAP可以使用TAP作为内标物,测定TAP可以使用CAP作为内标物。表5-4列出部分APs残留的GC分析方法。


6.3.2 LC

APs中均含有强紫外吸收的芳香环结构,因此可以配合使用紫外检测器(UVD)和二极管阵列检测器(DVD)进行HPLCUPLC检测。虽然该方法不需要衍生化,但是易受内源性物质干扰,灵敏度一般比GC低。

UPLC是在LC原理上发展而来的,具有填料粒径更小、系统体积更低和检测快速等特点,因此其分离速度、灵敏度和分离度等比HPLC均有所提高。

FFFFA的液相色谱图见图5-5

为建立CAPTAPFF的多残留检测方法,Nagata等使用不同填料的三种色谱柱,用甲醇水(2:8)作为流动相研究了这三种药物的保留时间。在Inertsil ODS-2柱上,FFTAPCAP的保留时间分别为5.11min9.07min18.0min;在Inertsil C8柱上分别为5.44min9.76min19.56min;在TSK-GEL 80TM分离柱上,对应的保留时间为5.86min10.69min19.26min。在这三种色谱柱上,该类抗生素色谱峰形均良好。FFTAP在色谱柱上保留时间较短,且在短波长225nm处有强的紫外吸收,因此可以先在225nm处检测FFTAP,后将波长切换到278nm处检测CAP



6.3.3 GC-MS

GC-MS用于食品中APs残留分析已经成为一种比较成熟的方法,该方法仍然是国内外食品中APs残留检测定性定量的主要方法之一。硅烷化后的APs有几个丰度比较大的离子,可利用的碎片离子较多,该方法灵敏度高。该方法主要采用电子轰击源(EI)和化学电离源(CI),其中负离子化学电离源(NCI)是APs残留的灵敏方法。

2008年,我国国家标准对动物源性食品中APs残留建立了定性确证和定量测定方法。其中GC-MS采用NO-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺三甲基氯硅烷(BSTFATMCS99:1)于70℃硅烷化,用GC-NCI-MS测定,内标(m-CAP)工作曲线法定量。APs标准物质衍生物的总离子流色谱图及各物质衍生物质谱图见图5-6和图5-7

6.3.4 LC-MS/MS

LC测定APs的定性方法有二极管阵列检测器和质谱检测器。由于实际样品中样品基质比较复杂,目标药物含量较低,二极管阵列检测器一般不能满足当前需求。LC-MS因具有选择性好、基质干扰少、信噪比高、检出限低等优点,已成为APs残留检测的准确定性和定量检测的主要方法。目前,LC-MSGC-MS成为国内外食品中APs残留的主要定性定量和确证方法。表5-5列出了部分LC分析方法。

6.4 其他方法

随着科学技术的发展,与新技术/新材料相结合的残留检测技术不断涌现出来。Dumonta等用表面等离子共振(SPR)生物传感器同时检测了虾中APs残留,其CAP检出限达0.1μg/kg。武会娟等运用纳米生物传感器进行CAP的残留检测,其检出限为0.01ng/L,且检测时间大大缩短,成本低。总之,由于APs在残留毒理学中的重要意义,近几十年的分析方法一直较多。目前食品中其残留分析主要采用HPLCGC检测、GC-MSHPLC-MS/MS确证。但GCGC-MS需要衍生化,耗时且步骤繁琐,而HPLCHPLC-MS/MS不需要衍生化,目前应用较广泛。免疫分析法适合筛查和现场监控,其阳性样品再用GC-MSHPLC-MS/MS确证。同时,生物传感器技术结合免疫分析法的快速和色谱法的灵敏、准确,也将是未来APs残留检测的发展方向。


 



以上内容来自

《动物源性食品安全危害及检测技术》是一本实用的专业技术参考书,可为国内广大动物源性食品安全检测领域技术人员提供参考资料。全书共包括七部分内容,第一部分介绍了动物源性食品安全的基本概念、危害因素以及检测技术概况;第二部分至第七部分分别针对动物源性食品中主要危害因素,如细菌、寄生虫、霉菌毒素药残留、农药残留、污染物等,对其相关检测技术进行了详细介绍,并列举了多种检测方法应用实例,具有很强的实用性和指导性,对一线检验检测人员的工作具有很好的指导作用。


扫码购书


天猫旗舰店

中国农业出版社

微信公众号

中国农业出版社

★ ★ ★



往期 · 回顾

动物源性食品中霉菌毒素的检测——伏马菌素

动物源性食品中霉菌毒素的检测——赭曲霉毒素

名企直聘 | 职等你来

【梦想的舞台】易者同心,共筑未来!青岛易邦2021年技术类岗位招聘啦!

中国兽医发布由农业农村部畜牧兽医局主管,中国动物卫生与流行病学中心主办,《中国动物检疫》编辑部承办。欢迎您积极投稿、建言献策,投稿邮箱:zgsyfb@cahec.cn,联系电话:0532-85623545。

点开二维码图片

关注中国兽医发布

点开二维码图片

关注中国动物检疫

作者:曲志娜 赵思俊等

公众号:中国兽医发布

原文链接:http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzAxNzMyNzU0Mw==&mid=2650430481&idx=7&sn=63e1e32288c4cfcdeb394f437329ed9e&chksm=83e9c8c9b49e41df91567c5d24a3321314ec6b4f2101ef2e0f93a47b2a4849fa86a24cc3e0ba&scene=0&xtrack=1#rd

发布时间:2021-07-22 18:50:51

发表评论

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注