/ 中国兽医发布_流行病学新疆野生北山羊小反刍兽疫病毒分子特征

中国兽医发布_流行病学新疆野生北山羊小反刍兽疫病毒分子特征

由汪萍等发表于2021-07-13 17:02:35

摘要:为了解新疆野生北山羊小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)的分子特征,根据GenBank公布的PPRV基因组序列设计并合成引物,采用RT-PCR方法和基因测序技术获得病毒全基因序列,应用分子生物学分析软件,对分离的PPRV毒株进行序列分析。结果显示,本次分离的PPRV毒株(China/XJAKS/2017)属于基因IV型,基因组全长15954 nt,编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白;在系统进化上,与国内新疆分离株China/XJBZ/2015、China/XJYL/2013同源率分别高达99.0%、99.6%,与国外的巴基斯坦和塔吉克斯坦分离株亲缘关系最近。结果表明,PPRV已经在家养动物与野生动物之间传播。结果提示,PPRV传入野生动物群为我国消除PPR带来极大困难,需加强我国边疆地区PPR免疫隔离带建设,并对野生动物PPRV分子流行病学特点进行追踪监测。
小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性传染病,主要感染小反刍动物,以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。绵羊、山羊、小反刍类野生动物均对PPRV易感。牛、水牛、骆驼、猪也可感染PPRV,但除骆驼外很少表现临床症状。部分易感野生动物以及牛、猪等家养动物感染PPRV后不发病,但体内可持续隐性带毒,这为PPR防控带来潜在威胁。自2013年新疆霍城县发生PPR以来,2014—2016年新疆鄯善、博乐、库车、乌鲁木齐等地的野生北山羊、盘羊、瞪羚也出现PPRV感染引起的死亡。2017年,新疆阿克苏地区发现2只野生北山羊死于PPRV感染。由野生动物感染PPRV的报道可见,PPRV不但对野生动物濒危物种的生存构成严重威胁,还因野生动物中PPRV的持续存在,影响PPR全球根除计划的完成。因此,除对家养动物进行疫苗免疫外,还需要持续加强对野生动物感染PPRV的关注。研究我国野生动物的PPRV分子生物学特征,可为制定系统、全面、有效的PPR防疫策略提供技术支撑。



材料与方法



材料
2017年1月,新疆阿克苏地区2只野生北山羊异常死亡,临床症状疑似PPRV感染。采集肺和淋巴结,将组织研磨,冻融3次后12 000 r/min离心20 min,取上清提取RNA。RNA提取试剂盒,QIAGEN公司产品;One step RT-PCR kit,Takara公司产品;DNA凝胶回收试剂盒,AXYGEN公司产品。
引物设计与合成
根据GenBank公布的PPRV基因组序列,设计14对寡核苷酸引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
病毒RNA提取和RT-PCR
按QIAGEN RNeasy MINI Kit 说明书提取病毒RNA,取5 μL提取的RNA于50 μL反应体系进行RT-PCR反应(Takara One step RT-PCR kit)。反应条件如下:50 ℃,30 min进行反转录;94 ℃,2 min进行Taq酶激活;30个循环的PCR(94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min);72 ℃,10 min延伸。
序列测定
将RT-PCR鉴定为阳性的产物,命名为China/XJAKS/2017。按AXYGEN DNA凝胶回收试剂盒说明书步骤进行胶回收。将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
基因组和系统发育分析
用DNAstar 4.0软件和Clustal W方法,对China/XJAKS/2017的全基因组序列和推导的氨基酸序列进行比较,并与其他具有代表性的PPRV株进行比较。基于全长基因组,N基因核苷酸序列进行系统发育分析,采用MEGA 5.0软件,确定PPRV的进化趋势。



结果




RT-PCR
用14对PPRV特异性引物进行RT-PCR,通过1%琼脂糖凝胶电泳检测,获得14个基因片段(图1)。

China/XJAKS/2017基因组长度及特点
利用DNAstar 4.0 软件,将分段获取的China/XJAKS/2017基因序列拼接,得到的基因组全长为15 954 nt,与GenBank上公布的China/XJYL/2013、China/XJBZ/2015、CH/HNZM/2014、CH/HNNY/2014、China/BJ/2014、CH/GDDG/2014这6个毒株的全基因组序列长度完全一致。而与全基因组长度为15 948 nt的 Nigeria 75/1、ICV89、Oman 1983等国外分离毒株基因组长度不同,多出了6 nt。与其他参考毒株相比,China/XJAKS/2017第4 828位点有1个碱基(C)缺失,第5 214位点有1个碱基(C)插入。突变和缺失主要集中在基因组的第4 500~5 224位(图2~3)。

China/XJAKS/2017与其他PPRV毒株的基因同源性比较
通过全基因组比对发现,China/XJAKS/2017与同为基因IV型的中国分离株同源率高,尤其和2个新疆分离株(China/XJYL/2013、China/XJBZ/2015)同源率最高,分别达99.6%、99.0%。与基因I型和III型毒株的同源率低,为87.0%~90.2%,其中与KN5/2011同源率最低,为87.0%(图4)。

China/XJAKS/2017与2个新疆分离株(China/XJBZ/2015、China/XJYL/2013)、1个西藏分离株(China/Tibet/2007)、2个疫苗株(Sungri/96、Nigeria/75/1)进行同源性比较发现:3″UTR、N、P、V、C、M、F、H、L、5″UTR的全长基因组同源性分别为92.5%~99.1%、93.4%~99.8%、92.7%~99.5%、93.3%~99.2%、92.3%~99.1%、93.8%~99.80%、92.9%~100%、91.1%~99.3%、93.6%~99.5%、91.7%~100%和92.1%~99.6%。氨基酸水平上,L蛋白和N蛋白保守性最高,分别为97.0%~99.4%和94.5%~99.6%;非结构蛋白V蛋白和C蛋白的保守性最低,分别为87.9%~98.7%和88.8%~98.3%。作为病毒感染细胞和诱导中和抗体最重要的F蛋白和H蛋白,China/XJAKS/2017与基因II型疫苗株Nigeria/75/1的同源率分别为96.5%和92.5%(表1)。

China/XJAKS/2017的系统进化分析
为确定China/XJAKS/2017的分类地位,分别以不同地区、不同年代及不同基因型的PPRV毒株N基因和全基因序列为基础绘制了进化树。N基因进化分析结果(图5)显示:China/XJAKS/2017属于基因IV系;在N基因核酸序列水平上,China/XJAKS/2017与除西藏地区分离毒株外的其余中国分离株亲缘关系最近,同在一个小的分支;与国外毒株相比,则与邻国巴基斯坦和塔吉克斯坦分离毒株亲缘关系最近。全长基因组系统进化分析结果(图6)显示,在全基因核酸序列水平上,China/XJAKS/2017同样与除西藏以外的国内其他分离株遗传距离最近,共同形成一个小分支,而西藏分离株则与印度分离株亲缘关系最近。




讨论



PPRV分子生物特征显示,China/XJAKS/2017比Nigeria 75/1、ICV89、Oman 1983等国外分离毒株的全基因组长度多了6 nt,与China/XJYL/2013、China/XJBZ/2015、CH/HNZM/2014、CH/HNNY/2014、China/BJ/2014、CH/GDDG/2014这6个毒株不仅基因组长度相同,而且在M和F蛋白之间的第5 222~5 227位比其他毒株多出6 nt,但这并没有影响结构蛋白和非结构蛋白的大小。核苷酸同源性分析表明,China/XJAKS/2017与China/XJYL/2013全基因核苷酸同源性为99.6%。由此可见,自2013年新疆发生PPR以来,随着时间的推移,PPRV有从新疆西北部向南传播的态势。China/XJAKS/2017虽然出现了个别位点的缺失或插入,但与China/XJYL/2013相比,变异程度较低。
通过遗传进化分析可以看出,China/XJAKS/2017与国内毒株特别是新疆本地分离的PPRV毒株最相似。与国外毒株相比,与巴基斯坦和塔吉克斯坦分离的PPRV毒株最相似。因此,分析PPRV的分子生物学特点对于病毒溯源有一定参考意义。
China/XJAKS/2017与疫苗株Nigeria/75/1的H蛋白同源性为92.5%。而H蛋白是诱导产生中和抗体的蛋白。目前商品化PPR活疫苗(Nigeria75株或sungri96株)被认为能保护所有基因谱系。我国PPRV基本属于基因IV型。2007年以来,基因II型的Nigeria75株作为疫苗株在我国应用,免疫效果良好。但疫苗接种后的保护水平还受疫苗株和田间毒株抗原差异的影响,因此各地发病率也不同,我国有的地区已经达到免疫无疫,但有的地区还呈现点状散发。另外,自然环境中存在不同宿主来源的病毒,如野生动物以及带毒的非易感家养动物、康复动物或疫苗接种动物。它们在病毒进化过程中的作用机制尚不清楚,因此要达到消除PPRV的目标,除对家养动物免疫外,还需对不同宿主来源的病毒进行分子流行病学研究。 
新疆地理位置特殊,与俄罗斯、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、塔吉克斯坦、巴基斯坦、蒙古国、印度、阿富汗接壤。而阿富汗、印度、塔吉克斯坦和巴基斯坦等国家的PPR疫情常年呈地方性暴发流行。近年来,新疆与哈萨克斯坦、蒙古国接壤的地区发生了北山羊、盘羊、瞪羚感染PPRV引起死亡的事件。PPR作为一种自然流行疾病,将长期存在于野生动物中,并相互传播。这不但对濒危野生小反刍动物造成威胁,可能在野生动物之间、野生动物与牲畜之间传播,这为我国消除PPR带来困难。综上所述,新疆PPR防控形势依然严峻,需加强我国边疆地区PPR免疫隔离带建设,并对野生动物感染的PPRV分子流行病学特点进行追踪监测。

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(责任编辑:朱迪国)

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作者:汪萍等

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