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中国兽医发布_动物源性食品中寄生虫的检测——新孢子虫

由曲志娜 赵思俊等发表于2021-07-10 11:59:15

新孢子虫(Neospora caninum)属于孢子虫纲、新孢子虫属,是寄生在多种动物体内的一种原虫,主要引起孕畜流产或死胎以及新生儿的运动障碍和神经系统疾病。新孢子虫病是世界性奶牛流产的主要原因,给奶牛业造成严重的经济损失。目前还没有人感染新孢子虫病的报道。

1 病原学特征

1988年美国Dubey等首次从一只下肢瘫痪的犬脑组织中分离到该虫体,并且将其命名为犬新孢子虫。犬新孢子虫(Neospora caninum)属于顶复门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoa sida)、真球虫目(Eucocciida)、肉孢子虫科(Sarcocystidae)、新孢子虫属(Neospora)。

新孢子虫的生活史尚不完全清楚,其全部发育过程需要两个宿主,在终末宿主体内进行类似球虫的发育,在中间宿主体内进行肠外期发育。犬新孢子虫在发育阶段出现数种不同的形态,其中对速殖子、组织包囊和卵囊的了解比较深入。速殖子呈卵圆形、月牙形或球形,大小为(4.8~5.3)μm×(1.8~2.3)μm,大多数寄生于带虫空泡中。组织包囊简称包囊,呈圆形或卵圆形,大小一般为(15~35)μm×(10~27)μm,直径可达100μm,包囊壁厚1~3μm,其内包被的缓殖子大小为(3.4~4.3)μm×(0.9~1.3)μm。卵囊呈卵圆形,其直径为10~11μm,孢子化卵囊内含2个孢子囊,每个孢子囊内含4个子孢子。

终末宿主犬吞食组织包囊后,虫体在小肠上皮细胞中大量繁殖,发育为卵囊,卵囊随粪便排出。卵囊在适宜的环境条件下发育为具有感染性的孢子化卵囊。中间宿主包括多种家畜和野生动物食入孢子化卵囊污染的饮水或者饲料后被感染。在感染的急性阶段,子孢子迅速发育繁殖为速殖子,速殖子可以侵入多种有核细胞。当宿主的免疫应答将体内的大部分虫体清除掉后,速殖子转变为缓殖子,缓殖子能在细胞内形成组织包囊而长期存在。

2 流行病学特征

该病呈世界性分布,广泛存在于英国、美国、澳大利亚、新西兰、荷兰、丹麦、韩国、日本、中国等国家。该病一年四季均可发生,但高峰多出现在夏季。新孢子虫病对中间宿主牛而言是一种重要寄生虫病,是引起牛流产的主要原因,严重危害养牛业的发展,引起的流产常呈散发性或地方性流行,感染母畜不存在年龄差异,以妊娠6个月以前流产的胎儿血清抗体阳性率较高,同一母畜可能反复发生流产。刘群和邓冲等对全国11个省份的不同奶牛场3500余份奶牛血清检测显示,新孢子虫抗体阳性率为0~95%,平均为25%左右,统计分析表明血清抗体阳性母牛与流产发生呈显著相关,而且进行了流产胎牛体内新孢子虫的鉴定,首次证实我国流产胎牛脑组织中存在新孢子虫。

3 危害

新孢子虫病对中间宿主牛而言是一种重要寄生虫病,对牛场的畜牧业生产有极大的影响。新孢子虫病是引起牛流产的原发性疾病。在英国12.5%牛流产是由新孢子虫病引起,荷兰为15%~20%,美国加利福尼亚州为20%~43%。澳大利亚的新孢子虫病也很严重,奶牛场血清阳性率达到30%~35%。

牛新孢子虫病主要表现为患牛四肢虚弱无力、弯曲、后肢麻痹、运动失调,明显的头部震颤、头盖骨变形、眼睑反射迟钝、角膜轻度浑浊。妊娠母牛流产或者产死胎,即使能产下犊牛,犊牛体质虚弱,体重较轻,严重者出现瘫痪、畸形、共济失调、肌肉萎缩、抽搐或其他运动系统疾病。牛的病变为小脑发育不全、脑炎、脊髓炎,脊髓中灰质少,形成灶性空洞,在病变中可检查到新孢子虫的组织包囊。心肌炎比较严重,心肌的单核细胞中有大量的速殖子寄生。肝门静脉周围单核细胞浸润,出现不同程度的坏死灶。胎盘绒毛层的绒毛坏死,并有虫体病灶。

4 检测方法

新孢子虫病的诊断要结合临床症状、流行病学、病理组织学变化的特点,应用多种检测方法进行综合诊断。血清学检测和PCR检测是诊断新孢子虫病的有效方法。

4.1 病原学检测

4.1.1 病原的分离与培养

采集新鲜死胎的脑组织,在含青霉素和链霉素的PBS溶液中无菌匀浆,19~25号针头过滤,加入胰蛋白酶消化,离心,最后沉淀悬浮于含有2%马血清、青霉素和链霉素的RPMI-1640中,取0.5mL悬浮液接种于单层Vero细胞中,37℃培养观察。Yamane等将犊牛组织接种于牛心肺主动脉内皮细胞和猴肾细胞中培养,接种后49d观察到新孢子虫速殖子。直接分离可见的虫体并不容易成功,可先将病料组织皮下接种小鼠、大鼠、沙鼠、犬、猫、家兔等,发病后采集中枢神经或内脏组织进行特异性检验,可提高检出率。

4.1.2 免疫组织化学检测

采集病死动物的大脑、脊髓、肝、肾、胎盘或其他病变部位,用兔抗新孢子虫血清对经福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片染色,可以检测到新孢子虫速殖子和缓殖子,并且这种方法与刚地弓形虫及其他球虫目的病原体无交叉反应,但不够敏感,尤其是胎儿组织自溶时,这种方法不能做出准确诊断。

4.1.3 病理组织学检查

采集动物流产胎儿的脑、脊髓、心脏及肝等组织进行常规组织学检查。神经系统病变以非化脓性脑脊髓炎为主要特征,并且病灶周围有单核细胞浸润。心脏多表现为多灶性心肌炎和多灶性心内膜炎。肝脏表现为坏死性肝炎,有大量浆细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和少量中性粒细胞浸润。肝门静脉周围单核细胞浸润,出现不同程度的坏死灶及纤维蛋白血栓。但要确诊必须检测到新孢子虫速殖子或组织包囊。

4.2 血清学检测

有多种血清学方法用于检测新孢子虫抗体,其中IFAT和ELISA应用广泛,且检测结果的特异性和敏感性都较高。但ELISA与IFAT比较,其优越性表现在操作规范化,不受主观因素的影响,同时更适用于大批量样本的检测,例如进行血清学调查。

4.2.1 直接凝集试验(DAT)

经福尔马林固定的完整速殖子在特异性抗体的作用下发生凝集,用于检测IgG和IgM抗体。Packham等用新孢子虫DAT和IFAT两种检测方法对16种不同种属动物的血清进行检测,认为DAT较IFAT有一定的灵敏度和特异性。DAT不需要特定的设备和种属特异性的二抗就可以对大量血清样品进行流行病学调查,但是对新孢子虫诊断抗原制备要求比较高,要保证速殖子的完整性。

4.2.2 ELISA

ELISA具有较高的特异性、敏感性和稳定性,操作简便,方法类别多且易于掌握,适用于临床病例的诊断和流行病学调查。新孢子虫病ELISA主要建立在整体或部分纯化的自然的新孢子虫抗原、重组的新孢子虫抗原、新孢子虫抗体活性以及新孢子虫特异性竞争抑制性单克隆抗体的基础上。

天然抗原ELISA:速殖子通过反复冻融后超声裂解,再经离心提取水溶性成分作为包被抗原,包被在酶标板上,加入待检血清,再滴加酶标记的二抗(如辣根过氧化物酶标记的抗绵羊IgG),利用酶的催化作用和底物放大反应原理,对待检抗体进行定性和定量分析。Pare等于1995年首次将ELISA用于牛的新孢子虫抗体的检测,利用牛速殖子裂解物作为抗原建立的ELISA的灵敏度和特异性分别为89%和97%。

重组抗原ELISA:将新孢子虫致密颗粒蛋白、膜表面蛋白基因克隆,通过与谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)一起作为融合蛋白而使之在大肠杆菌中表达。将纯化的重组蛋白作为抗原包被酶标板,用于检测新孢子虫抗体。目前已经报道了关于致密颗粒蛋白和膜表面蛋白等重组蛋白的ELISA。Chahan等用新孢子虫表面蛋白1(NcSAG1)建立ELISA,与弓形虫感染的血清没有交叉反应。Lally等分别应用30ku和35ku的新孢子虫致密颗粒蛋白6和致密颗粒蛋白7(NcGRA6和NcGRA7)的两种重组蛋白为抗原建立了ELISA,急性感染牛的血清经这两种方法检测与IFAT有很好的一致性。刘晶等利用新孢子虫体外重组表面蛋白dNcSRS2蛋白作为包被抗原,建立检测新孢子虫血清抗体的间接

ELISA,试验结果证明该方法的重复性好、特异性强、灵敏度高,与IFAT和ELISA试剂盒的符合率均达到92%以上。

免疫刺激复合物ELISA:将新孢子虫的粗提抗原与免疫刺激复合物(皂苷、胆固醇、磷脂相)结合作为包被抗原,检测新孢子虫病,并且与弓形虫或其他亲缘关系较近的原虫没有交叉反应。Bjorkman等用该方法对240头流产的荷斯坦牛的血清进行检测,结果显示有190头牛检测为阳性,阳性率为79%。与IFAT比较,该方法具有96%的特异性,并且同其他相近的寄生虫没有交叉反应。

4.2.3 间接荧光抗体试验(IFAT)

将完整速殖子固定在载破片上,与待检血清共孵育,然后与荧光素标记的二抗相作用,在荧光显微镜下观察。可用于测定血清和初乳中新孢子虫IgG抗体效价,具有高度的敏感性、特异性和重复性。Conrad等于1993年首次应用IFAT对牛血清进行新孢子虫抗体检测。延边大学鲁承等对从吉林省21个县、市牛群中采取的1091份牛血清进行了间接荧光抗体检测,其新孢子虫血清抗体阳性率为17.32%。

4.3 分子生物学诊断

应用较多的主要是PCR,可从流产胎牛的组织内检测到新孢子虫DNA,但也能从牛乳中检测到新孢子虫DNA。

4.3.1 PCR

NcSRS2和Nc-5基因是新孢子虫的重要功能基因,与弓形虫的同位基因的同源性很低。Hempill等设计了一对特异性引物,扩增NcSRS2基因,并进行序列比较,可以确诊新孢子虫的存在与否。Muller等用特异性引物Np6/Np21扩增Nc-5基因,建立PCR,能检测到1mg组织中的1~10个速殖子。岳韬等利用PCR对流产奶牛血样进行检测,其敏感性试验显示,最低能检出DNA量为2.5pg。应用于PCR的其他靶基因有18S rDNA、28S rDNA基因等。

4.3.2 巢式PCR

Lally等利用一对特异性NS1和TS3引物建立巢式PCR扩增rDNA的ITS1,可以证明新孢子虫的存在,该方法能够检测到25个速殖子,相当于2pg基因组DNA;Medina建立巢式PCR,能检测到0.01~0.1个速殖子的基因组,灵敏度是目前建立的新孢子虫PCR检测方法中最高的。

4.3.3 单管套式PCR

Ellis等设计合成内外两对引物,建立单管套式PCR,第一轮反应中用通用引物先扩增出18S rDNA,第二轮再用特异性引物扩增新孢子虫18S rDNA。这种PCR诊断法对于靶序列的特异性复制产物特别敏感,可从分离于自然感染的牛的经福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品中扩增新孢子虫DNA,达到临床诊断的目的。

4.3.4 定量PCR

定量PCR用于检测的目的基因是Nc-5基因,此方法能进行新孢子虫DNA定性和定量检测,成为研究新孢子虫病发病机理的重要方法。在定量PCR的基础上,发展应用特异性荧光探针的实时定量PCR。

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《动物源性食品安全危害及检测技术》是一本实用的专业技术参考书,可为国内广大动物源性食品安全检测领域技术人员提供参考资料。全书共包括七部分内容,第一部分介绍了动物源性食品安全的基本概念、危害因素以及检测技术概况;第二部分至第七部分分别针对动物源性食品中主要危害因素,如细菌、寄生虫、霉菌毒素药残留、农药残留、污染物等,对其相关检测技术进行了详细介绍,并列举了多种检测方法应用实例,具有很强的实用性和指导性,对一线检验检测人员的工作具有很好的指导作用。


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作者:曲志娜 赵思俊等

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发布时间:2021-07-10 11:59:15

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